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新冠核酸檢測操作流程及實驗室儀器之離心機
點擊次數:6766 更新時間:2020-02-26

疫情的發生,讓全國民眾的心都懸浮在半空中,除了對自身安全的擔憂,對于抗戰在一線的醫護人員以及檢測人員同樣有著極大的擔心,因為他們所接觸的是確診的病例,稍有不慎即可能感染。

近日,北京協和醫院發布了新型冠狀病毒核酸檢測標準操作流程,供其他符合條件的醫療機構在開展新型冠狀病毒核酸檢測時參考。

一、個人三級防護穿戴

帶一次性帽子、佩戴醫用N95口罩、一次性防護服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一層乳膠手套、外層一次性隔離衣、防護目鏡、第二層乳膠手套、穿戴完畢后應盡快通過緩沖間或者走廊,進入核酸提取區(專業核酸提取實驗室)。

二、樣本滅活處理

新冠核酸檢測須有兩名工作人員快速通過進入實驗室,進行滅活實驗操作。生物安全柜內需配備吸水棉與消毒酒精、有條件可配備吸水臺布,對樣本溢灑時進行緊急處理;打開二級容器,用75%酒精消毒物體表面,檢測樣本管密閉性后進行滅活處理,滅活條件(56℃,30min,水浴等多種方式),取出酒精滅活管用酒精擦拭外表,將樣本放入到生物安全柜內。

三、手工核酸提取

操作人員進入試劑配置區或者單獨的潔凈實驗室。

(一)試劑區準備

根據說明說要求,在AW1中加入無水乙醇130mL,在AW2中加入無水乙醇160mL,計入無水乙醇后及時做好標記,在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE,并顛倒混勻使Carrier RNA充分溶解,就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置,而后通過傳遞窗傳送到樣本處理區,或者由專人送到核酸提取實驗室中。

二、樣本的裂解

用1.5ml的無菌EP管,移液器移取560μl AVL裂解液,加入5.6μl Carrier RNA,加入140μl的已滅活的待提取核酸的待測樣本,渦旋振蕩15s,室溫靜止10min。將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物,防止污染。裂解完成后,加入560μl無水乙醇,振蕩混勻15s,將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物,防止污染。

向離心柱加入裂解產物630μl,8000轉離心1min(例如NACHT納赫特離心機NACHT C-30R,文末附相關參數),若離心機在生物安全柜之外,每次使用都需進行外表面消毒。更換新廢液收集管,要從離心機中小心取出離心柱,將上層離心柱轉移到新收集管中,繼續將剩余裂解產物630μl加入離心柱中,若樣本體積大于140μl時需重復此步驟,直到全部裂解產物都過柱離心,8000轉離心1min,小心將離心柱轉移到新的收集管中。

取500μl AW1加入離心柱中(注意,此處加樣操作時務必將移液器吸頭接觸離心柱內壁緩慢加樣),8000轉離心1min。小心取出離心柱,更換新的收集管。

取500μl AW2加入離心柱中,14000轉離心3min,小心取出離心柱,更換新的離心柱上端收集管,置于離心機中使用大轉速離心1min,以確保將AW2中的殘液*離心干凈。

取無菌1.5mlEP管收集核酸,將離心柱上端小心放入1.5mlEP管中,取40-60μl的洗脫液AVE加入到離心柱中(注意:洗脫液應盡量全部覆蓋住離心柱膜),用EP管管蓋蓋住離心柱,使用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋。

室溫靜止1min,將其放入離心機中8000轉離心1min,回收核酸。丟棄離心柱,EP管中即為獲取的提取核酸,做好標記與登記。

四、用儀器提取核酸

首先按照說明說準備核酸提取試劑,將200μl滅活樣本添加到核酸提取試劑中,根據核酸提取儀的設置程序上機提取核酸,等儀器操作結束,提取核酸完成,回收核酸。

五、PCR體系配置

根據檢測樣本數量配制體系,將配制好的PCR體系充分混勻并離心后,將其通過傳遞窗送至樣本處理核酸加樣區,或單獨的樣本加樣實驗室。按照每孔分裝20μL反應體系,進行分裝,在各孔分別加入5μL待測樣本核酸或陰陽對照物(請注意每次檢測器包含1個陽性對照和3個陰性對照且陰性對照需隨機分布),密封PCR管,有條件時模板加樣盡量在單獨的生物安全柜進行。

工作人員將配好的PCR管通過傳送窗口送至PCR擴增區,或由專人送至PCR擴增實驗室,上機檢測。

六、上機檢測及結果分析

工作人員進入基因擴增分析實驗室,從傳遞窗取出PCR反應管,上機前需混勻并離心反應體系,按試劑盒說明說設置擴增參數并分析判讀結果。分析結果時,嚴格閱讀說明說充分了解試劑盒靈敏度、方法學局限性等綜合判讀實驗結果。

為防止擴增污染,反應結束后的PCR擴增管嚴禁開蓋并裝入密封帶中裝入的垃圾桶中。

七、檢測后的消毒處理

新冠樣本處理完成后,工作人員應用75%的酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套,放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。檢測完成后,生物安全柜臺面和地面應用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇進行擦拭。將安全柜內產生的醫療垃圾用三層垃圾袋密封,并將其放入垃圾桶中,垃圾袋上需標記醫療垃圾信息。實驗結束后,生物安全柜以及實驗室均要進行紫外燈照射消毒,時間至少30min。

實驗操作人員,應有他人用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇對一次性隔離衣均勻噴霧消毒處理,而后脫去隔離衣將新冠檢測醫用垃圾放入制定垃圾桶中,工作人員在離開二級實驗室后,應在緩沖區或走廊按順序摘脫個人三級防護用品,首先應帶新的外層手套,摘掉護目鏡并置于75%乙醇中消毒,自上而下、自內向外翻轉脫掉一次性防護服,脫去外層手套,摘除口罩、一次性帽子、脫一次性鞋套。脫掉手套,新冠病毒防護服均需進行高壓滅菌處理。高壓前后醫療垃圾嚴格區分。

新冠病毒相關垃圾需在120度,30min條件進行濕熱高壓處理,以高壓試紙條變色為有效,而后作為普通醫療垃圾處理。

NACHT  C-30R技術參數:

NACHT  C-30R

比較大轉速

30000 r/min

比較大相對離心力

65403 xg

比較大容量

6×100 mL /4×400 mL

功率

700W

顯示

LCD顯示屏

加減速

0-19

電機

免維護無碳刷變頻電機

溫度范圍

-20℃~+40℃

快速冷卻

比較大轉速下小于4℃

制冷劑

環保制冷,不含氯氟烴

開蓋方式

電動鎖定機蓋,自動開蓋

轉子

角轉子、水平轉子、酶標板轉子等

時間控制

10 s ~ 99 h

尺寸(長寬高)

660×630×355 mm

開蓋高度

890mm

重量

100 Kg

噪音

<63 dB

可配容量為0.2~85 mL的角轉子,0.5~400 mL的水平轉子及酶標板轉子。

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